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Aug 17, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12763 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Docetaxel (Doc) ist ein Eckpfeiler der Chemotherapie; Allerdings führt die Behandlung mit Doc häufig und unweigerlich zu Arzneimittelresistenzen und der Bildung polyploider Riesenkrebszellen (PGCCs). In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von Doc auf nichtkleinzelligen Lungenkrebs, um die Rolle von PGCCs bei der Arzneimittelresistenz und die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die diese Resistenz regulieren. Wir fanden heraus, dass Doc den Stillstand des G2/M-Zellzyklus und den Zelltod in A549- und NCI-H1299-Zellen verursachte. Viele Zellen blieben jedoch am Leben und wurden zu PGCCs, indem sie die Expression wichtiger regulatorischer Proteine ​​im Zusammenhang mit dem Zellzyklus und der Zellproliferation verringerten. Bemerkenswerterweise zeigten die PGCCs typische Merkmale der Seneszenz, insbesondere eine Hochregulierung der p21- und p-Histon-H2A.X-Expression. Darüber hinaus war der mRNA-Spiegel von IL-1β im Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp mit der Entwicklung von PGCCs signifikant erhöht. Die Hemmung von IL-1β reduzierte die Expression von p-Histon H2A.X und förderte die Polyploidie, um die proapoptotische Wirkung von Doc zu verstärken. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass IL-1β an der Bildung von PGCCs beteiligt ist und die Seneszenz von PGCCs reguliert, was zur Arzneimittelresistenz gegen Doc beiträgt. Daher könnte die gezielte Bekämpfung von IL-1β in PGCCs ein neuartiger Ansatz zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen sein.

Lungenkrebs ist weltweit ein häufiger bösartiger Tumor, wobei nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) etwa 85 % ausmacht und die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität ist1. Die Chemotherapie ist eine der traditionellen Behandlungen und Doc ist ein Eckpfeiler der Chemotherapie bei NSCLC2. In vielen Fällen verlängert Doc das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben, führt aber auch unweigerlich zu Arzneimittelresistenzen und Rückfällen nach einer Chemotherapie3,4. Doc ist ein Mikrotubuli-hemmender Wirkstoff, der bei der Mitose zum Stillstand des Zellzyklus führt, wonach die Zellen entweder bei der Mitose absterben oder auf abnormale Weise austreten (mitotische Verschiebung) und als polyploide Zellen überleben5. Polyploidie ist ein konservierter Mechanismus bei Stressreaktionen, und mehrfacher Behandlungsstress, einschließlich Chemotherapeutika, kann eine Polyploidisierung von Tumorzellen auslösen6, was zur Bildung von PGCCs führt. Es wird angenommen, dass PGCCs in hohem Maße mit Therapieresistenz und Tumorrepopulation nach der Therapie zusammenhängen7,8. Obwohl PGCCs bereits vor über einem Jahrhundert beschrieben und zunehmend anerkannt wurden, sind die Mechanismen, die der Bildung von PGCCs zugrunde liegen, und ihre Rolle bei der Arzneimittelresistenz noch nicht eindeutig geklärt.

Zelluläre Seneszenz wird üblicherweise als ein zellulärer Zustand des Stillstands des Zellzyklus und der Hemmung der Proliferation definiert9. Dieser Prozess wird zunehmend als wichtiges Konzept in der Krebsbiologie anerkannt. Eine Chemotherapie kann eine zelluläre Seneszenz induzieren, die ein anderes Schicksal als der Zelltod darstellt und möglicherweise mit PGCCs zusammenhängt10. Tatsächlich gehen PGCCs immer mit einem seneszenten Phänotyp einher, einschließlich einer sich nicht teilenden hypertrophen Zellmorphologie, einem Stillstand des Zellzyklus und einer erhöhten β-Galactosidase-Aktivität11. Darüber hinaus stellen PGCCs eine vorübergehend seneszierende Subpopulation von Krebszellen dar, die als Reaktion auf eine Chemotherapie entstehen12. Obwohl seneszierende Zellen die Fähigkeit zur Proliferation verlieren, bleiben sie am Leben und behalten ihre Stoffwechselaktivität10. Daher können PGCCs dem Schicksal des Todes durch einen speziellen Mechanismus entgehen, bei dem sie einen seneszenten Phänotyp annehmen.

Seneszierende Zellen unterliegen Stoffwechselveränderungen und sezernieren eine Reihe aktiver Faktoren, die als seneszenzassoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP)13 bezeichnet werden. Es wird angenommen, dass entzündliche Zytokine im SASP entscheidend für die Krebsentstehung und den Erwerb von Arzneimittelresistenzen sind14. IL-1β ist ein wichtiges Entzündungszytokin und Krebsbehandlungen können die IL-1β-Produktion fördern15. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass IL-1β direkt von Tumorzellen produziert werden kann, was zu einem Therapieversagen führt16. Obwohl IL-1β häufig mit Arzneimittelresistenzen in Zusammenhang steht, ist die Rolle von IL-1β bei der Arzneimittelresistenz noch nicht eindeutig geklärt.

In der aktuellen Studie untersuchten wir die Wirkung von Doc auf die Bildung und Seneszenz von PGCCs bei NSCLC und konzentrierten uns dabei auf die Rolle von Entzündungsfaktoren bei diesen Prozessen. Unsere Studie zeigte, dass Doc den G2/M-Zellzyklusstopp induziert und die Bildung von PGCCs fördert. Auf dieser Grundlage stellten wir fest, dass PGCCs typische Merkmale der Seneszenz aufwiesen und dass IL-1β im SASP mit der Entwicklung von PGCCs signifikant zunahm. Bemerkenswerterweise reduzierte die Hemmung von IL-1β die Expression von p-Histon H2A.X (γ-H2A.X) und förderte die Polyploidie, um die proapoptotische Wirkung von Doc zu verstärken. Unsere Daten legen nahe, dass die gezielte Behandlung von IL-1β in PGCCs eine vielversprechende Strategie zur Umkehrung der Chemoresistenz gegen Doc sein könnte.

Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Primärantikörper sind im Zusatzmaterial (Zusatzdatei 1 für Tabellen S1 und S2) aufgeführt. Alle Stammlösungen wurden vor der Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die humanen NSCLC-Zelllinien A549 und NCI-H1299 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) bezogen. Die Zellen wurden in DMEM/F-12-Medium (Shanghai Basalmedia Technologies Co., Ltd.) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; VivaCell) kultiviert und in Gegenwart von 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Für die Doc-Behandlung wurden die Zellen 24 Stunden lang mit Doc bei 100 nM behandelt und konnten sich dann drei Tage lang in normalem Medium erholen. Die Zellen wurden in drei Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Doc-Gruppe (24 Stunden) und Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage. Zur Behandlung mit Diacerein wurden die Zellen vor der Behandlung mit Doc. 24 Stunden lang mit 1 μM Diacerein behandelt, um IL-1β zu hemmen. Die Zellen wurden in 4 Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, Dia-Gruppe, Doc-Gruppe und Doc + Dia-Gruppe. Als Vehikelkontrolle wurde dem Kultursystem DMSO zugesetzt.

Zur Markierung der Zellmembran und des Zellkerns wurden die Farbstoffe Dil (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) und Hoechst 33342 (Beyotime; Shanghai, China) verwendet. Die Zellen wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (ABC Biochemistry; Hongkong, China) ausgesät und mit Doc. behandelt. Anschließend wurden die Zellen einmal in PBS gespült und 20 Minuten (min) in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach 30-minütiger Inkubation mit Dil (5 μM) und Hoechst 33342 (1:100) bei 37 °C wurde die Morphologie der Zellen unter einem Ti-S-Umkehrfluoreszenzmikroskop (Nikon, Japan) mit NIS-Elements D 3.2 sichtbar gemacht Software.

Die Morphologie der Zellen wurde unter einem herkömmlichen Lichtmikroskop (Nikon, Japan) abgebildet. Nach der Aufnahme der Bilder wurden alle greifbaren Zellen (anhaftende/lebensfähige Zellen und schwimmende Zellen) im Kultursystem gesammelt und die Anzahl der Zellen in einer Hämozytometerkammer unter einem Mikroskop gezählt.

Die Zellen wurden geerntet, einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und über Nacht bei –20 ° C in 80 % eiskaltem Methanol fixiert. Anschließend wurden die Zellen in 500 μl PBS mit PI (50 μg/ml) resuspendiert und 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Analyse des Zellzyklus und des DNA-Gehalts wurde mit einem FACS Canto® Π-Durchflusszytometer (BD Canto; San Jose, CA, USA) durchgeführt. Die Zellzyklusverteilung wurde mit der FlowJo 7.6-Software analysiert und der DNA-Gehalt wurde mit der BD FACSDiva-Software analysiert.

Die Wirkung von Doc auf die Apoptose von A549- und NCI-H1299-Zellen wurde unter Verwendung des 7-AAD/PE Annexin-V-Apoptose-Nachweiskits (BD Biosciences; San Jose, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Zellen wurden gesammelt und in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml in 1 ml Bindungspuffer (1 ×) resuspendiert. Die Zellsuspension (100 μl) wurde mit 5 μl Annexin V (PE) und 5 μl 7-AAD 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Dann wurde 1 × Bindungspuffer (400 μL) hinzugefügt. Die Fluoreszenzintensitäten von PE Annexin-V oder 7-AAD wurden mit einem FACS Canto® Π-Durchflusszytometer analysiert und 10.000 Zellen in jeder Probe ausgewertet.

Die Zellen wurden auf Deckgläsern in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen ausplattiert und dann mit Doc. behandelt. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde ein SA-β-Gal-Färbekit (Beyotime; Shanghai, China) verwendet, um die an den Deckgläsern haftenden Zellen nachzuweisen. Die Entwicklung der blauen Farbe in Zellen wurde mit einem Ti-S-Umkehrmikroskop abgebildet.

Es wurden Proteinextraktion und Immunblotting durchgeführt17. Kurz gesagt, die Zellen wurden gesammelt und zweimal mit vorgekühltem PBS gewaschen. Das Gesamtprotein wurde unter Verwendung von RIPA-Lysepuffer, der Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails enthielt (Roche; Basel, Schweiz), extrahiert. Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines Pierce BCA-Proteintestkits (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Für die Western-Blot-Analyse wurden gleiche Mengen an Proteinprobe (ca. 30 μg) verwendet. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet.

Sechs Wochen alte männliche BALB/c-nude-Mäuse wurden von Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning, China) bereitgestellt. Die in 100 μl PBS suspendierten menschlichen NSCLC A549-Zellen (5 × 105 Zellen) wurden subkutan in die rechte Flanke von Nacktmäusen injiziert und konnten dort Tumore bilden. Als das Tumorvolumen ungefähr 100 mm3 erreichte, wurden tumortragende Mäuse randomisiert in zwei Gruppen eingeteilt: PBS-Gruppe und Doc-Gruppe, mit 5 Mäusen in jeder Gruppe, denen einmal alle 7 Tage PBS oder Doc (10 mg/kg) intraperitoneal injiziert wurde Insgesamt 4 Mal. Nach 4 Wochen wurden die Mäuse durch Zervixluxation gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren (2020) eingeschläfert. Die Tumoren wurden operativ entfernt und fotografiert. Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (Genehmigungsnummer CSE202108002) durchgeführt. Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) berichtet. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Maustumorgewebe wurde in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 μm-Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Ethanolreihe hydratisiert. Für die H&E-Färbung wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Für die IHC-Färbung wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit 0,3 % H2O2 inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu reduzieren. Die unspezifische Bindung wurde 30 Minuten lang mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und die Schnitte wurden mit Primärantikörpern gegen Hp1α/β (1:200) oder HMGB1 (1:200) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubation mit einem biotinylierten Sekundärantikörper bei 37 °C wurde die Antikörperbindung durch 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Färbung sichtbar gemacht.

Das mitochondriale Membranpotential wurde mit JC-1-Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit Doc und Diacerein behandelt und dann wurden 1 × 105 Zellen geerntet und in 1 ml DMEM/F12-Medium resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation mit JC-1-Farbstoff (2,5 mg/l) unter Standard-Zellkulturbedingungen wurde die Fluoreszenzintensität beider mitochondrialer JC-1-Monomere und -Aggregate mithilfe eines FACS Canto® Π-Durchflusszytometers mit der BD FACSDiva-Software erfasst. Die Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials in jeder Zellgruppe wurde basierend auf dem Prozentsatz der JC-1-Monomere berechnet18.

Nach der Behandlung mit Doc und Diacerein wurde die DNA-Schadensreaktionssignalisierung durch Nachweis der Expression von γ-H2A.X (Cell Signaling Technology) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden gesammelt, 15 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd fixiert und mit 2 ml eiskaltem 90 % Methanol 2 Stunden lang bei –20 °C permeabilisiert. Nach zwei Wäschen mit PBS zur Entfernung von Methanol wurden die Zellen in 100 μl PBS mit 0,5 % BSA resuspendiert. Die Zellen wurden 1 Stunde lang mit dem Antikörper γ-H2A.X (Alexa Fluor® 488 Conjugate) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS zur Entfernung des überschüssigen Antikörpers wurden die Zellen in 300 µl PBS resuspendiert und die Expression von γ-H2A.X wurde mit einem FACS Canto® Π-Durchflusszytometer mit BD FACSDiva Software analysiert.

Die Gesamt-RNA wurde mit RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Zellen extrahiert. Insgesamt 1 µg RNA wurde als Vorlage für eine Reverse-Transkriptionsreaktion unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-Kits (TaKaRa Bio) verwendet. Die erzeugte cDNA wurde dann durch qPCR unter Verwendung von TB Green Premix Ex Taq (TaKaRa Bio) analysiert und unter Verwendung von ABI 7500-Echtzeit-PCR-Systemen (Thermo Fisher Scientific) unter Einhaltung der PCR-Thermocycling-Bedingungen quantifiziert: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten; anschließende 40 Zyklen von 95 °C für 30 s (s) und 60 °C für 40 s. Die mRNA-Expression des Zielgens wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode19 analysiert und durch Normalisierung auf GAPDH (Homo) und β-Actin (Mus) bestimmt. Die verwendeten Primer sind im Zusatzmaterial aufgeführt (Zusatzdatei 2 für Tabelle S3).

Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt und alle Ergebnisse der Balkendiagramme werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit der SPSS-Softwareversion 20.0 durchgeführt. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde der Student-t-Test verwendet, und Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem LSD-Post-hoc-Test durchgeführt. Werte von P < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. In den grafisch dargestellten Daten bezeichnen *or#, **or## und ***or### Werte von P < 0,05, 0,01 bzw. 0,001.

Die NSCLC-Zelllinien A549 und NCI-H1299 wurden 24 Stunden lang mit Doc behandelt und konnten sich weitere drei Tage erholen. Der Versuchsaufbau ist in Abb. 1A dargestellt. Um den Einfluss von Doc auf das Zellschicksal zu bestimmen, haben wir zunächst die Zellzyklusverteilung analysiert. Wie in Abb. 1B gezeigt, stiegen die Fraktionen von A549- und NCI-H1299-Zellen in der G2/M-Phase schrittweise von 19,73 ± 0,51 und 19,19 ± 1,76 % nach 0 Stunden auf 60,76 ± 0,83 und 56,90 ± 1,33 % nach 6 Stunden (6 Stunden). vs. 0 h, P < 0,05) und 81,53 ± 2,25 und 72,82 ± 2,33 % nach 12 h (12 h vs. 0 h, P < 0,05). Nach 24-stündiger Doc-Exposition wurden jedoch Sub-G1- und Super-G2-Fraktionen gefunden (Abb. 1B und ergänzende Zusatzdatei 3 zu Abb. S1), sodass die Fraktionen von A549- und NCI-H1299-Zellen in der G2/M-Phase abnahmen signifikant auf 60,79 ± 8,20 und 31,05 ± 4,17 % nach 24 Stunden (24 Stunden vs. 12 Stunden, P < 0,05). Diese Daten zeigten, dass Doc in beiden Zelllinien einen Stillstand des G2/M-Zellzyklus verursachte, gefolgt von Zelltod und Polyploidie.

Doc führte zum Stillstand des G2/M-Zellzyklus und zur Bildung von PGCCs. (A) Experimentelles Design. Die Zellen der NSCLC-Zelllinien A549 und H1299 wurden 24 Stunden lang mit Doc bei 100 nM behandelt und dann drei Tage lang in einem wirkstofffreien Medium kultiviert. (B) Das Fortschreiten des Zellzyklus wurde durch Durchflusszytometrie erfasst und mit der Software Flow Jo 7.6 nach Doc-Behandlung für 6, 12 und 24 Stunden analysiert. Der Prozentsatz der Zellen in der G2/M-Phase wurde in den Histogrammen dargestellt. (C) Die Morphologie der Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, nachdem die Zellen mit Dil und Hochest 33.342 (× 200) gefärbt wurden. Rote Pfeile zeigen die Zellen mit Riesenkern an. Balken = 100 μm. (D) Der DNA-Gehalt der Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und der durch die schwarze Linie (P2) markierte Bereich zeigt die polyploiden Zellen (DNA > 4N). Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz der PGCCs (polyploide Zellen). N = 3, die Daten wurden als Mittelwert ± SD angezeigt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet: *P < 0,05, ***P < 0,001 und ###P < 0,001.

Interessanterweise hatte sich die Morphologie von Zellen, die 24 Stunden lang Doc ausgesetzt waren, stark von spindelförmig zu flach verändert, und die Größe dieser Zellen wurde mit der Verlängerung der Kulturzeit größer (Ergänzung, Zusatzdatei 4 für Abb. S2). Daher haben wir die Morphologie der Doc-induzierten Zellen unter Verwendung des Farbstoffs Dil und Hoechst 33342 weiter analysiert. Die Größe und Kerne der Zellen nahmen nach der Doc-Behandlung zu und erreichten ihre größte Größe in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage (Abb. 1C). Selbst in einer einzigen vergrößerten Zelle, die als PGCC bezeichnet wurde, wurden mehrere Kerne oder Riesenkerne beobachtet (Abb. 1C). Der DNA-Gehalt der mit Doc behandelten A549- und NCI-H1299-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie weiter analysiert. Wie in Abb. 1D gezeigt, stieg der Prozentsatz der PGCCs stark von 8,20 ± 4,53 und 4,83 ± 1,72 % in der Kontrollgruppe auf 17,60 ± 3,86 und 26,37 ± 3,51 % in der Doc-Gruppe (24 Stunden) und auf 44,07 ± 0,90 und 45,80 ± 1,73 % in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage, was deutlich mehr war als in der Kontrollgruppe und der Doc-Gruppe (24 Stunden) (P < 0,05). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PGCCs aus NSCLC-Zellen erzeugt werden könnten, die mit Doc induziert wurden.

Im Einklang mit dem Stillstand des Zellzyklus hemmte Doc die Proliferation von A549- und NCI-H1299-Zellen. Wie in Abb. 2A gezeigt, wurde die Anzahl der Zellen von 8,98 ± 0,28 und 8,18 ± 0,54 (× 104 Zellen/cm2) in der Kontrollgruppe auf 3,24 ± 0,53 und 3,78 ± 0,54 (× 104 Zellen/cm2) in der Doc.-Gruppe reduziert (24 h)-Gruppe und auf 0,64 ± 0,17 und 0,75 ± 0,08 (× 104 Zellen/cm2) in der Doc (24 h) + 3 Tage-Gruppe, deutlich mehr als in der Kontrollgruppe und der Doc (24 h)-Gruppe (P < 0,05). Darüber hinaus stieg der Prozentsatz der Apoptose in A549- und HCI-H1299-Zellen von 6,03 ± 0,76 und 8,40 ± 0,62 % in der Kontrollgruppe auf 13,73 ± 0,75 und 21,27 ± 0,21 % in der Doc-Gruppe (24 Stunden) (Abb. 2B). Dieses Ergebnis stimmte mit dem Anstieg der Sub-G1- und Super-G2-Fraktionen überein (Ergänzung, Zusatzdatei 3 für Abb. S1). Mit dem Anstieg des DNA-Gehalts und der Bildung von PGCCs nach drei Tagen Erholung stieg der Prozentsatz der Apoptose in A549- und HCI-H1299-Zellen nicht weiter an (Abb. 1C, 2B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Doc die Proliferation von NSCLC-Zellen hemmte, indem es Zelltod und Polyploidie auslöste.

Doc reduzierte die Expression von Schlüsselproteinen, die mit dem Fortschreiten und der Proliferation des Zellzyklus zusammenhängen. (A) Die Anzahl der Zellen wurde in einer Hämozytometerkammer unter einem Mikroskop gezählt und in den Histogrammen dargestellt. (B) Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie mit 7-AAD- und PE-Annexin-V-Doppelfärbung bewertet. Q2: frühe Apoptose; Q4: späte Apoptose; Q2 + Q4: apoptotische Untergruppe; Q3: lebensfähige Untergruppe. Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz der Apoptose. (C) Proteine ​​wurden extrahiert und die Expressionsniveaus von Cdc2, p-Cdc2, RB, p-RB und E2F1 wurden dann durch Western Blot analysiert. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. N = 3, die Daten wurden als Mittelwert ± SD angezeigt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet: ***P < 0,001 und ###P < 0,001.

Da Doc nicht nur den Stillstand des Zellzyklus induzierte, sondern auch die Zellproliferation hemmte, untersuchten wir weiter die Wirkung von Doc auf die Expression von Schlüsselproteinen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus und der Zellproliferation. Cdc2 (CDK1) ist ein Schlüsselregulator des G2/M-Phasenübergangs20,21 und die Hemmung von CDK kann die Phosphorylierung des Retinoblastomproteins (RB) blockieren und so die durch E2F22 vermittelte Transkription proliferativer Gene verhindern. Daher wurde die Expression von Cdc2, p-Cdc2, RB, p-RB und E2F1 durch Western Blot analysiert. Wie in Abb. 2C gezeigt, waren die Proteinspiegel von Cdc2 und p-Cdc2 nach der Doc-Behandlung reduziert, insbesondere in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage. Dementsprechend wurde in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage eine geringere Expression von RB und p-RB beobachtet (Abb. 2C). Der Proteingehalt von E2F1 war ebenfalls reduziert, insbesondere in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage (Abb. 2C). So könnte Doc NSCLC-Zellen zur Bildung von PGCCs anregen, indem er die Expression wichtiger regulatorischer Proteine ​​im Zusammenhang mit dem Zellzyklus und der Zellproliferation moduliert.

Doc-induzierte PGCCs zeigten einige charakteristische Merkmale der Seneszenz, wie z. B. eine vergrößerte und abgeflachte Morphologie (Ergänzungsdatei 4 zu Abb. S2) sowie einen irreversiblen Stillstand des Zellzyklus und eine Hemmung der Proliferation (Abb. 1B, 2A). Um zu bestätigen, dass Doc-induzierte PGCCs eine Seneszenz erlebten, verwendeten wir ein SA-β-Gal-Färbekit, um die Aktivität von β-Galactosidase nachzuweisen. Doxorubicin (132 nM) wurde als Positivkontrolle einbezogen, um die Seneszenzinduktion anzuzeigen23. Wie in Abb. 3A gezeigt, wurden A549- und NCI-H1299-Zellen nach der Doc-Behandlung vergrößert und abgeflacht und zeigten eine erhöhte β-Galactosidase-Aktivität (P < 0,05). Die positive Färbung von β-Galactosidase konzentrierte sich hauptsächlich auf große Zellen, insbesondere in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage (Abb. 3A). Daher induzierte Doc mit der Entwicklung von PGCCs einen seneszenten Phänotyp.

Durch Doc induzierte PGCCs erfuhren eine Seneszenz. (A) Die Zellen wurden mit einem Seneszenz-assoziierten β-Galactosid (SA-β-Gal)-Färbekit gefärbt und die Bilder wurden mit einem Umkehrmikroskop (× 200) aufgenommen. Schwarze Pfeile zeigen die SA-β-Gal-positive Zelle. Balken = 100 μm. Doxorubicin (132 nM) wurde als Positivkontrolle zur Darstellung der Seneszenzinduktion verwendet. (B) Proteine ​​wurden extrahiert und der Proteingehalt von p53 und p21 wurde dann durch Western Blot analysiert. Als Beladungskontrolle wurde β-Actin verwendet. (C) Die Expression von γ-H2A.X wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und der durch die schwarze Linie (P2) markierte Bereich zeigte die γ-H2A.X-positiven Zellen. Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz der γ-H2A.X-positiven Zellen. N = 3, die Daten wurden als Mittelwert ± SD angezeigt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet: **P < 0,01, ***P < 0,001 und ###P < 0,001.

Der p53/p21-Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Zellzyklusverlaufs, und aktivierte p53/p21-Signalwege sind typisch für Zellstress/Seneszenz24,25. Daher wurde die Expression der Proteine ​​p53 und p21 durch Western Blot bewertet. Nach der Behandlung mit Doc war der Proteinspiegel von p21 signifikant erhöht, insbesondere in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage (Abb. 3B). Obwohl Doc den Proteingehalt von p53 in A549-Zellen erhöhte, war die Induktion von p21 p53-unabhängig, da NCI-H1299-Zellen p53-null waren (Abb. 3B). Diese Daten legen nahe, dass die Expression von p21 möglicherweise mit der Bildung von PGCCs und dem Auftreten von Seneszenz zusammenhängt. Die DNA-Schadensreaktion ist ein wichtiger Mechanismus, der Seneszenz hervorruft24. Daher wurde die Expression von γ-H2A.X (ein Marker der DNA-Schadensreaktion) mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie in Abb. 3C gezeigt, stieg der Prozentsatz der γ-H2A.X-positiven Zellen in A549- und NCI-H1299-Zellen von 36,00 ± 1,65 und 55,43 ± 2,84 % in der Kontrollgruppe auf 52,07 ± 1,03 und 72,13 ± 3,52 % in der Doc-Gruppe (24 Stunden) und weiter auf 59,90 ± 2,04 und 76,57 ± 4,25 % in der Doc-Gruppe (24 Stunden) + 3 Tage, deutlich mehr als in der Kontrollgruppe (P < 0,05). Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung der DNA-Schadensreaktion möglicherweise mit der Bildung von PGCCs und dem Auftreten von Seneszenz zusammenhängt. Zusammengenommen zeigten diese Daten deutlich, dass Doc nicht nur PGCCs induzierte, sondern auch die Seneszenz förderte und diese beiden Prozesse möglicherweise durch p21 und das DNA-Schadensreaktionssignal gesteuert werden.

Die Zellalterung geht mit einem deutlichen Anstieg der ausgeschiedenen Mengen an löslichen Faktoren einher13. Unser besonderes Interesse galt der Untersuchung des Beitrags seneszenzassoziierter proinflammatorischer Zytokine zur Bildung von PGCCs und zur Seneszenz. Daher wurden die Spiegel von IL-1β-, IL-6- und IL-8-mRNA mittels RT‒qPCR analysiert, da diese wichtigen Entzündungsmoleküle an der Seneszenz beteiligt sind und vorwiegend in PGCCs exprimiert werden26. Wie erwartet waren die IL-1β-mRNA-Spiegel in A549- und NCI-H1299-Zellen in der Doc-Gruppe (24 Stunden) um das 3,6 ± 0,1- und 2,6 ± 0,8-fache und in der Doc-Gruppe um das 10,3 ± 0,5- und 30,3 ± 4,1-fache erhöht (24 h) + 3 Tage Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 4A, P < 0,05). Darüber hinaus waren die IL-8-mRNA-Spiegel in A549- und NCI-H1299-Zellen in der Doc-Gruppe (24 h) um das 8,9 ± 1,0- und 18,0 ± 3,6-fache und in der Doc-Gruppe um das 27,2 ± 1,6- und 35,9 ± 6,2-fache erhöht ( 24 h) + 3 Tage-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 4A, P < 0,05). Allerdings wurde der IL-6-mRNA-Spiegel durch die Doc-Behandlung nicht signifikant verändert (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigten, dass die Behandlung mit Doc die Expression von IL-1β und IL-8 mit der Entwicklung von PGCCs in vitro erhöhte.

Doc förderte die Expression von IL-1β in vitro und vivo. (A) Der mRNA-Spiegel von IL-1β und IL-8 wurde durch RT‒qPCR bestimmt. Die Werte wurden auf GADPH (Homo sapiens) normiert und auf die Kontrollgruppe bezogen. (B) Histologische Merkmale nach H&E-Färbung der mit A549-Zellen xenotransplantierten Nacktmäuse mit oder ohne Doc-Behandlung. Balken = 100 μm. Balkendiagramme zeigten die relative PGCC-Zahl. Der Prozentsatz der PGCC-Zahl (ungefähr das Dreifache der durchschnittlichen mononukleären Fläche) wurde quantifiziert und auf die PBS-Gruppe (Kontrolle) (N = 15) normalisiert. (C) Immunhistochemische Analyse von HP1α/β und HMGB1, exprimiert in den mit A549-Zellen xenotransplantierten Nacktmäusen-Tumorgeweben. Balken = 50 μm. Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz positiver Zellen. Die Expression von HP1α/β und HMGB1 wurde anhand des Prozentsatzes positiver Zellen (N = 8) quantifiziert. (D) Die relative mRNA-Expression von IL-1β in den mit A549-Zellen xenotransplantierten Tumorgeweben von Nacktmäusen wurde durch RT‒qPCR bestimmt. Die Werte wurden auf Aktin (Mus musculus) und relativ zur PBS-Gruppe (Kontrolle) normalisiert. N = 3, die Daten wurden als Mittelwert ± SD angezeigt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden eine einfaktorielle ANOVA und der Student-t-Test verwendet: *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001.

Das A549-Xenotransplantat-Tumormodell wurde entwickelt, um die Wirkung von Doc auf Tumorzellen in vivo zu untersuchen. Die H&E-Färbung zeigte, dass die Doc-Behandlung zur Bildung von PGCCs mit bizarren Kernen führte (Abb. 4B). Darüber hinaus förderte Doc die Expression von HP1α/β und HMGB1 (Markerproteine ​​der Seneszenz) auf histologischer Ebene deutlich (Abb. 4C). Diese Daten legen nahe, dass Doc in vivo die Bildung von PGCCs und Seneszenz induzierte. Basierend auf den in vitro beobachteten Daten haben wir die Wirkung von Doc auf die Expression von IL-1β und IL-8 in vivo weiter analysiert. Da IL-8 bei Mäusen deletiert ist, wurde der IL-1β-mRNA-Spiegel in tumortragenden Mäusen, die mit Doc behandelt wurden, mittels RT‒qPCR analysiert. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Ergebnissen war der IL-1β-mRNA-Spiegel nach der Behandlung mit Doc im Vergleich zu dem der PBS-Gruppe signifikant um das 23,3 ± 0,6-fache erhöht (Abb. 4D, P < 0,05). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Doc die Seneszenz und die Expression von IL-1β mit der Entwicklung von PGCCs in vivo förderte.

Um die Wirkung von IL-1β auf die Bildung und Entwicklung von PGCCs zu untersuchen, verwendeten wir Diacerein als Inhibitor von IL-1β. Wie in Abb. 5A gezeigt, blockierte Diacerein teilweise die Induktion von IL-1β durch Doc. Die Wirkung der Hemmung von IL-1β auf die Zellalterung wurde durch Analyse der Expression von γ-H2A.X bewertet. Diacerein reduzierte die Expression von γ-H2A.X signifikant, unabhängig davon, ob allein oder in Kombination mit Doc. Wie in Abb. 5B gezeigt, reduzierte die Behandlung mit Diacerein allein den Prozentsatz der γ-H2A.X-positiven Zellen in A549- und NCI-H1299-Zellen von 35,87 ± 0,76 und 49,70 ± 0,46 % in der Kontrollgruppe auf 30,70 ± 0,53 und 34,93 ± 1,12 % in der Dia-Gruppe (Dia-Gruppe vs. Kontrollgruppe, P < 0,05). Wichtig ist, dass die Behandlung mit Doc und Diacerein in Kombination den Prozentsatz der γ-H2A.X-positiven Zellen von 52,23 ± 0,31 und 60,63 ± 0,21 % in der Doc-Gruppe auf 49,23 ± 0,55 und 41,70 ± 0,95 % in der Doc + Dia-Gruppe reduzierte ( Doc + Dia-Gruppe vs. Dia-Gruppe, P < 0,05). Die Wirkung der IL-1β-Hemmung auf die Entwicklung von PGCCs wurde durch Analyse des DNA-Gehalts mittels Durchflusszytometrie weiter untersucht. Wie in Abb. 5C gezeigt, erhöhte die Behandlung mit Diacerein allein den Prozentsatz an PGCCs in A549- und NCI-H1299-Zellen nicht (Dia-Gruppe vs. Kontrollgruppe, P > 0,05). Allerdings erhöhte die Behandlung mit Doc und Diacerein in Kombination den Prozentsatz an PGCCs in A549- und NCI-H1299-Zellen von 33,70 ± 0,70 und 37,77 ± 0,93 % in der Doc-Gruppe auf 55,53 ± 0,81 und 42,53 ± 1,25 % in der Doc + Dia-Gruppe ( Doc + Dia-Gruppe vs. Doc-Gruppe, P < 0,05). Diese Daten zeigten, dass die IL-1β-Hemmung synergistisch die Bildung von PGCCs mit der Induktion von Doc förderte.

Die Hemmung von IL-1β behinderte die Seneszenz und erleichterte die Entwicklung von PGCCs. (A) Die relative mRNA-Expression von IL-1β wurde durch RT-qPCR bestimmt. Die Werte wurden auf GADPH normalisiert und relativ zur Kontrollgruppe. (B) Die Expression von γ-H2A.X wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und der durch die schwarze Linie (P2) markierte Bereich zeigte γ-H2A.X-positive Zellen. Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz positiver Zellen. (C) Der DNA-Gehalt der Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und der durch die schwarze Linie (P2) markierte Bereich zeigt die polyploiden Zellen (DNA > 4N). Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz der PGCCs (polyploide Zellen). (D) Mitochondriales Membranpotential wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Balkendiagramme zeigten den Prozentsatz der JC-1-Monomere. N = 3, die Daten wurden als Mittelwert ± SD angezeigt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet: ***P < 0,001, #P < 0,05 und ###P < 0,001.

Das mitochondriale Membranpotential wurde unter Verwendung des JC-1-Farbstoffs gemessen, um die Wirkung von IL-1β auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Wie in Abb. 5D gezeigt, lag der JC-1-Farbstoff in Form von Aggregaten in der Kontrollgruppe und der Dia-Gruppe von A549- und NCI-H1299-Zellen vor (Dia-Gruppe vs. Kontrollgruppe, P > 0,05), was auf eine Behandlung mit Diacerein allein schließen lässt hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Nach der Behandlung mit Doc allein stiegen die Anteile der JC-1-Monomerform in A549- und NCI-H1299-Zellen signifikant von 2,70 ± 0,75 und 2,37 ± 1,17 % in der Kontrollgruppe auf 35,97 ± 1,62 und 56,40 ± 1,78 % in der Doc-Gruppe Gruppe (Abb. 5D, Doc-Gruppe vs. Kontrollgruppe, P < 0,05). Bemerkenswerterweise erhöhte die Behandlung mit Doc und Diacerein in Kombination die Anteile der JC-1-Monomerform in A549- und NCI-H1299-Zellen weiter auf 42,97 ± 2,08 und 64,40 ± 1,49 %, deutlich mehr als in der Doc-Gruppe (Abb. 5D, Doc + Dia-Gruppe vs. Doc-Gruppe, P < 0,05). Diese Daten legen nahe, dass Doc eine Depolarisierung des mitochondrialen Transmembranpotentials verursachte, um Apoptose auszulösen, und dass die IL-1β-Hemmung die proapoptotische Wirkung von Doc synergistisch verstärkte.

Die Chemotherapie ist eine der klassischen Therapiemethoden bei bösartigen Tumoren. Obwohl Chemotherapeutika Krebszellen eliminieren können, indem sie den Zelltod durch Apoptose, Autophagie oder mitotische Katastrophe auslösen, kommt es häufig und unvermeidlich zu Arzneimittelresistenzen27. Chemotherapeutika wie Doc können die mitotische Spindel schädigen und die Mitose stoppen, was zu einer mitotischen Katastrophe und erheblichem Zelltod führt26. Chemotherapeutika führen jedoch auch zu einem Wechsel vom mitotischen Zellzyklus zum Endoreplikationszellzyklus, was zur Bildung von PGCCs führt, einer Form, die sich besser an die raue Lebensumgebung anpassen kann28. Die Bildung von PGCCs nach therapeutischer Intervention mit Chemotherapeutika, einschließlich Doc, ist gut beschrieben. Diese PGCCs können einen proinflammatorischen sekretorischen Phänotyp annehmen und zum Erwerb einer Chemoresistenz beitragen29. Hier fanden wir heraus, dass Doc in A549- und NCI-H1299-Zellen einen Stillstand des G2/M-Zellzyklus und Zelltod auslösen kann. Gleichzeitig induzierte Doc PGCCs, die typische Merkmale der Seneszenz zeigten. Das entzündliche Zytokin IL-1β im SASP wurde mit der Entwicklung von PGCCs deutlich erhöht und trug zur Doc-Resistenz bei.

Zelluläre Seneszenz wurde ursprünglich als ein stabiler Zustand des Stillstands des Zellzyklus und der Hemmung der Proliferation identifiziert, der auch als Stressreaktion angesehen wird, die in Krebszellen als Reaktion auf Bestrahlung oder Chemotherapeutika ausgelöst werden kann30,31, was als therapieinduzierte Seneszenz (TIS) bezeichnet wird. Die Zellalterung wird seit langem als synergetisch mit der Prävention und Kontrolle bösartiger Tumore angesehen und wird zunehmend als wichtiges Konzept in der Krebsbiologie anerkannt32. TIS scheint jedoch nicht von Vorteil zu sein, da es zu Chemoresistenz und einem erneuten Auftreten von Krebs führen kann. Jackson et al. fanden heraus, dass Seneszenz die Wirksamkeit einer Chemotherapie beeinträchtigen und das Wiederauftreten von Brustkrebs fördern könnte33. Wang et al. zeigten, dass ein Marker für TIS in vivo nach einer neoadjuvanten Therapie negative klinische Ergebnisse bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem NSCLC vorhersagte27. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die selektive Bekämpfung und wirksame Eliminierung alternder Zellen in vivo die therapeutischen Ergebnisse erheblich verbessern und die Lebensdauer von Versuchstieren verlängern kann34,35. In der klinischen Praxis kann die Seneszenz ein wichtiger Punkt sein, der nach einer Chemotherapie untersucht werden muss. In dieser Studie haben wir uns auf die Wirkung von Doc auf die Zellalterung konzentriert. Unsere Studie legt nahe, dass die Doc-Behandlung zur Zellalterung führt und dass das entzündliche Zytokin IL-1β im SASP zur Doc-Resistenz beiträgt. IL-1β ist nicht nur ein wichtiger Entzündungsfaktor, der von seneszenten Zellen ausgeschieden wird, sondern ist auch direkt oder indirekt an der Seneszenz beteiligt. Ashraf et al. betonten, dass IL-1β das kritischste Gen ist, das für die direkte Induktion der Seneszenz verantwortlich ist, um die phänotypischen und molekularen Eigenschaften von Chondrozyten zu verändern36. Li et al. und Chen et al. zeigte auch, dass IL-1β die Expression von SA-β-Gal37,38 deutlich steigerte. Darüber hinaus spielt IL-1β eine zentrale Rolle bei der Entzündungsreaktion und aktiviert eine Vielzahl von Signalwegen, darunter p38 MAPK, JNK, ERK und NF-κB. Diese Signalwege können zur Transkription von an der Seneszenz beteiligten Zielgenen wie IL-6 und IL-8 führen, die ein selbst- und kreuzverstärktes Seneszenz-/Entzündungsmilieu induzieren39.

IL-1β ist ein wichtiges proinflammatorisches Zytokin, das an Stress und chronischen Entzündungen beteiligt ist40. Chronische Entzündungen sind ein wichtiger Faktor bei der Karzinogenese und dem Fortschreiten des Tumors, und krebsbedingte Entzündungen gelten als wichtiger Marker für Krebs41,42. Obwohl IL-1β ausführlich in Immunzellen untersucht wurde, haben neuere Studien gezeigt, dass Tumorzellen auch IL-1β exprimieren, das direkt von Krebszellen produziert werden kann, die mit einer Reihe von Chemotherapeutika behandelt werden43. Es wurde jedoch gezeigt, dass IL-1β einen positiven Effekt auf die Chemoresistenz hat. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass IL-1β eine Rolle bei den schlechten Reaktionen auf eine Chemotherapie und den daraus resultierenden Therapieversagen spielt44,45. Lin Lu et al. zeigten, dass IL-1β die Arzneimittelresistenz von Plattenepithelkarzinom- und Melanomzellen im Kopf- und Halsbereich fördert46. Alexander et al. berichteten, dass chemoresistente Krebszellen IL-1β freisetzen können, das eine NF-κB-Amplifikationsschleife aufrechterhält, die für die Chemoresistenz verantwortlich ist47. Ji-Won Kim et al. fanden heraus, dass hohe IL-1β-Spiegel mit einem kürzeren Gesamtüberleben und einem progressionsfreien Überleben bei NSCLC-Patienten verbunden sind, die mit einer platinbasierten Kombinationschemotherapie behandelt werden48. IL-1β kann die Arzneimittelresistenz und das Überleben von Tumoren fördern und entwickelt sich als prognostischer Faktor für Patienten als Reaktion auf eine gezielte Therapie, was IL-1β zu einem möglichen Ziel macht, das möglicherweise in Betracht gezogen werden muss.

In dieser Studie haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass IL-1β durch seine Beteiligung an der Bildung von PGCCs und dem Auftreten von Seneszenz eine wichtige Rolle bei der Resistenz von NSCLC gegen die Doc-Chemotherapie spielt. Daher ist es sinnvoll, dass die gezielte Bekämpfung von IL-1β in PGCCs ein neuartiger Ansatz zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen sein könnte.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde 2019 durch den Key Research and Development Guidance Plan der Provinz Liaoning (CN) finanziert (2019JH8/10300082).

Labor für Grundmedizin, General Hospital of Northern Theater Command, No. 83 Wenhua Road, Shenhe District, Shenyang, 110016, Liaoning, China

Song Zhao, Sining Xing, Lili Wang, Mingyue Ouyang, Shuo Liu, Lingyan Sun und Huiying Yu

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HY, SZ, MO und LW haben die Studie entworfen. SZ, SX, MO, LW und SL bereiteten mit Hilfe von HY Material vor und führten Experimente durch. SZ, SX, MO und LW sammelten und analysierten die Daten. Die SZ hat das Manuskript verfasst und alle Autoren haben zu früheren Versionen des Manuskripts Stellung genommen. SZ, LS und HY trugen zur wiederholten Überarbeitung des Manuskripts bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Huiying Yu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, S., Xing, S., Wang, L. et al. IL-1β ist an der Docetaxel-Chemoresistenz beteiligt, indem es die Bildung polyploider Riesenkrebszellen bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs reguliert. Sci Rep 13, 12763 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39880-2

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Eingegangen: 20. April 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39880-2

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